利用CTAB法在多樣品組織研磨機上提取植物總DNA(以下內容只是簡單介紹,詳細情況,可咨詢本公司,)
一、實驗試劑:
1.CTAB抽提液:
2%(w/v)CTAB
100mmol/LTris-HCl(pH8.0)
20mmol/LEDTA(pH8.0)
1.4mol/LNaCl
抽提含多酚較多的植物材料時(比如木本植物),上述抽提液中可另加入2%的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。
抽提液于室溫保存,可在幾年內保持穩定。臨用之前向裝有上述抽提液的試管中加入約2%-3%(v/v)的β-巰基乙醇。
2、醋酸鈉:
3mol/LNaAc
用冰乙酸調pH值至4.8-5.2。
3、TE溶液:
4、其它:
無水乙醇,異丙醇,75%乙醇,酚:氯仿:異戊醇(25:24:1),氯仿:異戊醇(24:1),β-巰基乙醇,重蒸水。
二、實驗步驟
1.樣品研磨
1)取1g的樣品放入2mlepp管中
2)加入1-2粒5mm研磨珠
3)加入1ml的CTAB抽提液
4)將加有樣品的epp管放入多組織研磨儀的適配器中,蓋好
5)將研磨頻率調到60Hz,設定研磨時間為90秒(可根椐樣品的研磨的難易程度來調節,此數據是以銀杏落葉為樣本得出)
6)啟動研磨儀對樣品進行研磨(根據不同的樣品,本身性質不同,需要對研磨頻率和研磨時間進行適當的調整)
2.DNA的粗提
1)將研磨好的樣品取出于65℃水浴45min,中途間隔(輕柔)振蕩三次混勻
2)冷卻后加入等體積氯仿:異戊醇(24:1),輕柔顛倒混勻使乳化10min
3)7000g-8000g離心10min(18-20℃)
4)吸取上清于另一干凈的離心管中
5)(根據需要可用氯仿:異戊醇如上法重復抽提一次,吸取上清)
6)加入與上清液等體積(且已于-20℃預冷的異丙醇,顛倒混勻,約1至2分鐘后應有白色絮狀沉淀出現(若沒有,則加入上清液1/5至1/10體積的pH4.8-5.2的3MNaAc,混勻,于-20℃冰箱中沉淀30min)
7)離心法沉淀DNA
8)在75%乙醇中漂洗DNA數分鐘以上,用Tip頭吸干乙醇
9)用1ml75%乙醇再漂洗一次
10)沉淀于室溫或64℃以下的恒溫箱中干燥片刻至剛出現半透明,不要過度干燥
11)用50μlTE溶解沉淀,可用65℃水浴助溶,DNA粗提物可用于粗略PCR等。
3.DNA的純化
1)向TE溶解的DNA粗提物中入4-10μlRNaseA(約40-100μg)
2)于37℃酶解RNA1hr或65℃酶解RNA30min以上
3)加入50μl酚:氯仿:異戊醇(25:24:1),輕輕顛倒混勻10min
4)10000g以上常溫離心10min,吸取上清
5)加入50μl仿氯:異戊醇(24:1)輕輕顛倒10min
6)10000g以上常溫離心10min,吸取上清(根據需要可重復用氯仿:異戊醇如上法再抽提1-2次,以充分去除蛋白和酚)
7)向上清中加入1/5-1/10體積的pH4.8-5.2的3MNaAc,并加入2.5倍體積無水乙醇,于-20℃沉淀30min以上
8)12000g、4℃低溫離心10min,吸干液體
9)沉淀用75%乙醇漂洗二次
10)沉淀于室溫或64℃以下恒溫箱中干燥片刻至剛開始出現半透明狀,勿過度干燥加入50μl重蒸水溶解DNA,可于65℃水浴助溶
11)取5μlDNA電泳檢查DNA的質量
12)100-500倍稀釋后于分光光度計上測定OD260及OD280,分析DNA的濃度和質量
13)保存DNA于-20℃
補充:如果需要提取的樣品比較多(比如1g),研磨好的樣品在后續的提取中,需要轉移到大的epp管中,研磨時可以加入較少的抽提液,研磨完畢按照1g樣品10ml提取液補充抽提液,進行后續的操作。